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实验一、果蝇的饲养料理、性状不雅察和性别松弛
实验二、果蝇杂交实验
实验三、果蝇唾腺染色体的制备与不雅察
实验四、果蝇酯酶同工的遗传学分析
实验五、小鼠骨髓细胞染色体的制备与不雅察
实验六、一个拟南芥 InDel 分子标识遗传多态性检测和群体遗传学分析
实验一、果蝇的饲养料理、性状不雅察和性别松弛在遗传学实验中，有许多遗传划定的考证需用果蝇手脚实验材料。如分离划定、解放组合划定、伴性遗传划定及连锁呼叫划定的考证。一般进行一个杂交组合，只可考证一个划定。咱们此次承袭一次杂交设想来完成考证多个遗传划定。
一、实验倡导
1、了解果蝇的人命周期，生计习性及饲养料理方法。
2、掌执果蝇一些突变型的性状不雅察及牝牡性别松弛的方法。
二、实验旨趣黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）是被东说念主类沟通得最绝对的模式生物之一，果蝇属于虫豸纲、双翅目。手脚遗传实验材料有许多优点：
（1） 饲养容易。虫体小，以酵母为食，在饲养瓶中以玉米粉为饲料就不错正常滋长繁衍。生计史短。果蝇的生计周期包括：卵-幼虫-蛹-成虫。可在10-14天完成一个世代。
（2） 繁衍率高。雌蝇不错一次产下400个0.5毫米大小的卵。
（3） 染色体数量少。只消4对染色体，约180M。
（4） 唾腺染色体是雄伟染色体，是沟通染色体畸变和多样基因突变的好材料。
（5） 突变性状多。而且许多性状是容易不雅察的步地发育上的异常。举例眼色（冷眼、
红眼、棒眼、黑眼）；翅型（长翅、残翅、小翅、缺刻）；体色（灰体、黑檀体、黄体）；刚毛（直刚毛、焦刚毛）。
因此，果蝇在遗传学沟通中得到庸碌应用。
（一） 生计史：
果蝇是实足变态虫豸，它的生计史包括卵、幼虫、蛹及成虫四个发育时期。果蝇生计周期以及各发育阶段的时代漫骂与温度关系十分密切。跨越 30℃，能使果蝇不育和示寂。温度缩短，会使果蝇生计周期蔓延，生计力缩短。一般在 20-25℃下培养最为合适。在安妥的温度下，粗略经过 10-15 天即可繁衍一代。
（二） 果蝇牝牡辩认
关于团结品系的果蝇，雌果蝇体型较大、腹部终局稍尖、腹后面外不雅有 5 条玄色条纹，
无性梳，外生殖器外不雅纯粹，呈现圆锥状了得，神采较浅。而雄果蝇则体型较小、腹部终局顿圆、有性梳、外生殖器外不雅较复杂，尾部顿而圆，且神采较深。
雌果蝇 雄果蝇
（三） 常见突变类型
果蝇领有好多突变类型，且大多肉眼可不雅，本实验需要不雅察的果蝇性状如下表所示。
表2-1 需要不雅察的果蝇性状及具体表型。
器官
表型（野素性状/突变性状）
眼色
红眼/冷眼
体色
灰体/黑檀体
刚毛
直刚毛/焦刚毛
年轻的母亲在线翅型
长翅/短翅
三、实验材料、仪器和试剂
6 号： X 染色体的隐性突变体：灰体、冷眼、短翅、焦刚毛
26 号：Ⅲ号染色体隐性突变体：黑檀体、红眼、长翅、直刚毛
（证明：暗影部分为突变性状）
培养箱、麻醉瓶、剖解镜、剖解针、镊子、培养瓶、羊毫、滤纸、白瓷板。
乙醚、玉米粉、琼脂、红糖、酵母粉、丙酸等。
五、 实验表率
让学生用体视显微镜分别不雅察还是麻醉致死的不同果蝇品系对应的性状。特别要忽闪能准确松弛果蝇的牝牡。通过性梳、尾部斑点和腹部体节（环纹数量）。
性梳：雄性第一双足的跗节基部外侧有玄色鬃毛状性梳，雌性无；
斑点：果蝇尾部有无斑点（雌性腹部尖神采较浅，雄性腹部尖神采较深）腹部环纹的数量：雌性果蝇腹部分6节，有7条玄色环纹，雄性只消5节，6条环纹。
六、 忽闪事项
1.麻醉过度
2.放到培养瓶中时，要先把瓶子歪斜，待果蝇苏醒后再把瓶子竖起来，驻防果蝇粘在培养基中而不成苏醒。
3.挑果蝇用羊毫，忌用镊子和其他器具，以免影响果蝇滋长繁育。
七、 念念考题
1.怎样差别牝牡果蝇？
2.果蝇生计履历几个阶段？
附：培养基配制将 2.5 g 琼脂放在 200 mL 蒸馏水中，煮沸，直到琼脂实足融解，再加入 22 g 红糖或白糖，调匀，继续加热。另把 28g 玉米粉加入 50 mL 蒸馏水搀和后，倒入正在加热的琼脂糖溶液中，并加入融解在少许体积分数为 95%的酒精溶液中的 0.2 g 苯甲酸，均匀搅动，煮沸 2～3 min 成糊状，并趁热注入到洁净、干燥、消毒过的培养瓶中，分装 5 个培养基瓶内，使培养基在瓶底的厚度约 3 cm（忽闪瓶口和瓶壁上不要被培养基欺侮）。
水
80ml
玉米粉
8.25g
糖
6.2g
琼脂
0.6g
苯甲酸
0.5ml
酵母
少许
实验二、果蝇杂交实验 一、实验倡导1、学习果蝇杂交方法。
2、掌执对杂交驱散的统计与分析，沟通与考证三大遗传划定，并用 X2 考试数据。
二、实验旨趣通过果蝇杂交实验不错考证经典遗传学的分离划定、解放组合划定、伴性遗传划定及连锁互换划定。
分离划定：一双等位基因在杂合子中，各自卫持其寂然性，在配子酿成时，彼此分开，恐怕地进入不同的配子。解放组合划定：支配两对不同性状的等位基因，在杂合景况保持其寂然性。在配子酿成时，各等位基因彼此寂然分离，不同对的基因解放组合。伴性遗传：性染色体所佩戴的基因在遗传时与性别相筹商的遗传样式称为性连锁遗传或伴性遗传。连锁交换划定：位于团结双染色体上的基因蚁集在通盘共同遗传的频率大于重新组合的频率，重组体的产生是由于在配子酿成流程中同源染色体的非姐妹染色单体间发生了局部交换。
将两个纯系果蝇亲本进行正反交，取得 F1，字据正反交 F1表型判断哪些性状属于伴性遗传。然后 F1自交，统计 F2数据，分别中式一个单元性状、两个单元性状、三个单元性状进行分离划定、解放组合划定或连锁遗传划定的考证。
三、实验材料、仪器和试剂果蝇材料：
6 号： X 染色体的隐性突变体：灰体、冷眼、短翅、焦刚毛
26 号：Ⅲ号染色体隐性突变体：黑檀体、红眼、长翅、直刚毛证明：暗影部分为突变性状
培养箱、麻醉瓶、剖解镜、剖解针、镊子、培养瓶、羊毫、滤纸、白瓷板、乙醚、玉
米粉、琼脂、红糖、酵母粉、丙酸等。
四、实验表率正交：6 ♀ X 26 ♂ 反交：26 ♀ X 6 ♂
选处女果蝇—杂交—去亲本—不雅察后代—后代自交—移去亲本—不雅察统计后代—数据处理
1. 挑选处女蝇（由憨厚提前准备）：雌蝇成仙出来 10h 内一般不会交配，采选在这个时代段内网罗雌蝇，均属处女蝇。分牝牡分开挑选，具体操手脚：用滴独特滴乙醚的棉塞塞住瓶口，平放在桌面上约半分钟，果蝇即被麻醉，分性别装瓶。本实验将 26 号和 6 号果蝇分别培养使其产卵，9-10 天后网罗处女蝇（新成仙的雌躯壳细长，幼嫩的的真实透明，一般在 8-10h 内莫得交配才略，或经过 7-10 天的清贫饲养，莫得与任何雄蝇交配过，齐属于处女蝇。
2. 杂交：把牝牡果蝇字据实验要求搭配起来，装入一个瓶内，每瓶放 5-6 对，贴上标签，写明组合的亲本、杂交时代、实验者姓名。培养：第二天查验培养瓶，亲本若有示寂，应实时补充，培养瓶放在 25 度恒温箱中培养。忽闪随时查验培养基是否发霉，如有污染应立即更换新的培养基。
3. 第二周：对果蝇生计史进行阻碍不雅察。第一周接种的果蝇，经7-8 天培养后，除亲本（即当瓶壁上出现玄色蛹时撤除亲本）。之后将培养瓶继续放在恒温箱中培养再过 3-4 天，F1 成蝇开动出现。接下来的一周将 F1 移入新的培养瓶中进行兄妹交。
4. 第三周，不雅察纪录F1表型。在接种杂交亲本后约 11-12 天，F1 成虫开动成仙，在实验室中取出 F1 成蝇，不雅察纪录其表型和数量。每个杂交组合至少应统计 30 只。F1 兄妹交：取一新培养瓶，放 10-15 对 F1 果蝇进行自交。再过 7-8 天后撤除 F1 个体。
5. 第五周，即接种 F1 果蝇 11-12 天后，F2 开动成仙。逐批仔细不雅察多样表型并计数，
并用 X2 进行测验，证明试验驱散是否与表面数值相相宜。连气儿统计 4-5 天，以保证取得足足数量的被不雅察后代，被不雅察过的果蝇正法。每组统计 100-200 只。
6. 分别以个东说念主、小组、大组为单元整理数据，狡计重组值、并发率，作连锁图。分析转头影响试验驱散的身分。
预期驱散：
1、分离划定：体色松弛
黑檀体（ee）× 灰体（EE）→F1 灰体（Ee）→F2 （1:2:1，3:1）
2、解放组合划定：体色与翅形松弛
黑檀体长翅×灰体短翅→F1 灰体长翅→F2（9:3:3:1）
3、伴性遗传：眼色、性别松弛
红眼＞冷眼→F1 不论牝牡均为红眼，F1 牝牡互交，F2 红眼：冷眼=3:1，但无冷眼雌蝇
五、忽闪事项处女蝇的挑选决定确凿验的成败，是以一定要分清牝牡。忽闪乙醚麻醉果蝇时代不要太长，驻防果蝇示寂。统计性状时要忽闪不要相通统计。一定要忽闪实时按照时代表走动除亲本，驻防亲本和后代混杂在通盘，影响数据的准确性。雄性果蝇是实足连锁的。
六、念念考题1．为什么一定要挑选处女蝇？
2．在分开饲养的父本和母本中要是混杂了另一性别的果蝇，对父本照旧母本的影响更大?
为什么
实验三、果蝇唾腺染色体的制备与不雅察 一、实验倡导1. 熟识分离果蝇幼虫唾腺的技能，学习唾腺染色体的制片方法。
2. 不雅察了解果蝇唾腺染色体的步地学及遗传学特征。
二、实验旨趣本世纪初，D. Kostoff 用压片法开始在果蝇幼虫的唾液腺细胞核中发现了特别雄伟的染色体——唾液腺染色体（salivary gland chromosome）。事实上，双翅目虫豸（如摇蚊、果蝇等）的幼虫期齐具有很大的唾腺细胞，其中的染色体即是雄伟的唾液腺染色体。这些雄伟的唾液腺染色体具有许多报复特征，为遗传学沟通的许多方面，如染色体结构、化学组成、基因远隔抒发等提供了独到的沟通材料。
双翅目虫豸的悉数消化说念细胞发育到一定阶段之后就不再进行有丝分裂，而罢手在分裂间期。但跟着幼虫举座器官以及这些细胞本躯壳积的增大，细胞核中的染色体，尤其是唾液腺染色体仍抑止地进行自我复制而不分开，经过许屡次的复制酿成约 1000～4000 拷贝的染色体丝，合起来达 5×400 微米长，比普通中期相染色体大得多（约 100～150 倍），是以又称为多线染色体（polytene chromosome）和雄伟染色体（giant chromosome）。
唾液腺染色体酿成的率先，其同源染色体即处于紧密配对景况，这种景况称为“体细胞联会”。在以后抑止的复制中仍不分开，由此更仆难数条核卵白纤维丝合在通盘，紧密盘绕。
是以配对的染色体只呈现单倍数。
黑腹果蝇的染色体数为 2n=2×4，其中第 I（X 染色体）染色体为端着丝粒染色体（图21-1），第 II、第 III 染色体为中部着丝粒染色体，酿成唾腺染色体时辰别出现两条臂，第 IV 为很小的点状染色体。而唾液腺染色体酿成时，染色体着丝粒和近着丝粒的异染色质区聚于通盘组成一染色中心（chromocenter），是以在光学显微镜下可见从染色体中心处伸出6 条配对的染色体臂，其 5 条为长臂，1 条为紧靠染色中心的很短的臂（第 IV）（图 21-2）。
由于唾腺细胞在果蝇幼虫时期一直处于细胞分裂的间期景况，是以每条核卵白纤维丝齐处于伸展景况，因而不同于一般有丝分裂中期高度螺旋化的染色体。唾腺染色体经染色后，呈现浅深不同，疏密差异的横纹（band）。这些横纹的数量、位置、宽窄及陈列按次齐具有种的特异性。沟通合计这些横纹与染色体的基因是有一定关系，而一朝染色体上发生了缺失、相通、倒位、易位等，也可较容易地在唾腺染色体上不雅察识别出来。可见唾腺染色体技能是遗传学沟通中一项基本的技能。唾腺染色体的特质：
1、 雄伟染色体：5×400 微米，极度于普通染色体的 100-150 倍
2、 多线染色体：果蝇的唾腺细胞罢手在分裂间期，染色体核卵白纤维抑止复制，平行陈列酿成雄伟而伸展的多线染色体，染色体经屡次复制而不分开，每条染色体粗略有 1000-4000 条染色质丝
3、 体细胞联会：体细胞在有丝分裂流程中出现的同源染色体配对征象。由于体细胞同源染色体紧密而精准地配对，它们在全长上真实实足并行陈列，使得果蝇染色体只现二倍体染色体数倡导单元数。
4、 横纹结构：间期景况的染色体核卵白纤维丝处于伸展景况，每条染色体的染色线在不同的区段螺旋化进度不一，经碱性染料染色，出现浅深、疏密差异的横纹。不同染色体的横纹数量、时事和陈列按次是恒定的。期骗这些特征不仅不错松弛不同的染色体，还不错诱骗遗传试验驱散进行基因定位。20 世纪 30 年代，C.B.Bridge 发表首张多线染色体细胞学图谱。横纹的线性陈列代表基因的关系，用于染色体结构变异的风雅分析，易不雅察到染色体结构变异，是以唾腺染色体是沟通染色体畸变的好材料。
5、 Puff 结构：幼虫的不同发育时期，浓缩的染色质纤维会成群解旋、收缩，酿成泡状松散结构，西西掰阴艺术使相应的基因得以抒发，这种泡状结构称为 Puff 结构，亦称染色体的疏松。
图 1 果蝇唾腺（紫色标注）在虫体的位置。
A：肛门、 h：后肠、g：盲囊、mi：中肠、i：唾腺原基、mh：大腮钩、o：食说念、ph：咽头、pr：前胃、 sd：唾腺分泌管、sq；唾腺、mt：马氏管。
图 2 果蝇唾腺染色体结构图
三、实验材料、仪器和试剂黑腹果蝇三龄幼虫。
双筒剖解镜、光学显微镜、镊子、小烧杯、剖解针、载玻片、盖玻片、滤纸（吸水纸）。
四、实验表率1. 三龄幼虫的饲养和挑选
黑腹果蝇容易饲养，也易获唾腺，但为取得期望的染色体制片标本，需要承袭滋长风雅、形骸魁梧的三龄幼虫（化蛹前），以保证唾腺发育风雅。当幼虫爬上瓶壁准备化蛹即为三龄幼虫，此时虫体魁梧，便于剖解，是制备唾腺染色体的最期望时期。实验前不错将幼虫放在 50 ℃水浴锅的盖子上，受热之后幼虫会向瓶口爬去。
2. 幼虫唾腺的分离
（1） 当幼虫爬上瓶壁准备化蛹前即为三龄幼虫，此时虫体魁梧，便于剖解，是制备唾腺染色体的最期望时期。取一三龄幼虫置于载玻片上，并加上一滴生理盐水（如幼虫带有饲料可先用生理盐水洗净），置双筒剖解镜下查验。开始熟悉幼虫结构，头部稍尖，况兼有一斑点即口器，往往地舞动。
（2） 在剖解镜下用两支剖解针，一针压住头部，压点尽可能靠头部口器处。因为幼虫会蠕动，这一步需先熟识几遍。
（3） 幼虫头部固定之后，再用另一针压住尾端（尾端 1/3 处）（或用尖头镊子夹住），巩固快速一拉，使口器部分断开，体内各器官也从切口挤出，一双唾腺也随之而出。唾腺是一双透明的香蕉状腺体，仔细不雅察可发现由一个个较大的唾腺细胞组成。
（4） 分离的腺体可能伴有消化说念和脂肪体。在载玻片上再加一滴生理盐水，详情取得了腺体后，再用刀片或镊子仔细剔除这些杂物，仅让腺体留住，或将腺体吸到干净玻片上。
3. 唾腺染色体的制片和染色
（5） 用滤纸将弥漫的生理盐水吸去，忽闪不要碰着腺体，以防吸走。然后滴一滴 1N 的盐酸，浸泡 2-3 分钟，使组织疏松，以便压短暂细胞分散，染色体散开。（6）用吸水纸吸去盐酸，加 1 滴蒸馏水，轻轻冲洗后吸干，加 2 滴醋酸洋红或转换品红染色液，染色 5-20 分钟（此流程应保持腺体一直处于染液的浸泡中）。
（6） 染色后，盖上盖玻片，用滤纸轻轻吸去弥漫染液，然后放平在桌面，用大拇指压下盖片，可横向揉几下（忽闪不要使盖片滑动，且只朝一个处所揉动，不要来回揉！），多熟识几次，可望取得分散风雅的制片。
4. 不雅察驱散
果蝇唾腺组织未压片之前染色不雅察，可在显微镜下不雅察到被染色成深紫色的细胞核。压片后不雅察不错看见分散好的一团一团的染色体，而且有5条长臂。
本次实验的难点在于奏效分离果蝇唾腺，奏效分离的竣工的唾腺像是两根香蕉状的组织（图3.3）。压片奏效且配景干净的唾腺染色体是澄澈的一个中心区域相连着5条长臂（图 3.4）。要是什么也莫得染上，则有可能莫得分离到唾腺或者是在解离、染色和洗涤流程中丢失了唾腺。要是染色驱散是只消一团团的细胞核，则是因为解离不充分或者是压片力说念不够。反之要是压片过度则会导致染色体断裂成碎屑景况。
图3 体视镜下不雅察的唾腺组织
图4 分散较好的唾腺染色体
五、忽闪事项本次实验需要将体视镜的底部光源调暗或者关掉下光源。要是拉断了虫体，字据闭合、折光度、无色透明（与水的神采不异）的特质把唾腺挑取出来。不要把脑、胃等当成唾腺，脑为白色，的唾腺神采为白色。唾腺是无色透明。HCl 处理后唾腺体积很小，染色时染色液不要过多，以免压短暂唾腺随染液流走。果蝇唾腺为单层细胞组成，在剖解和制片流程中忽闪保湿。六、念念考题
1. 唾腺染色体的特征有哪些？
2. 奏效剖解唾腺组织的前提是什么？
3. 要是唾腺染色体的压片效能不好，应怎样加以改善?
操作视频可见中国大学 MOOC 网站上北京大学《遗传学实验》实验3和南京大学《遗传学实验》实验8
实验四、果蝇酯酶同工的遗传学分析 一、实验倡导1. 掌执聚丙烯酰胺凝胶电泳分离同工酶的技能。
2. 了解果蝇酯酶同工酶的遗传样式。
二、实验旨趣同工酶是指那些催化功能疏浚，而分子构型不同的酶。酶卵白分子的不同，反应了为它们编码基因的 DNA 碱基按次不同。期骗凝胶区带电泳不错将不同的同工酶分离，并期骗特异底物染色法使它们在凝胶上自大出迁徙率不同的活性区带。比拟亲代与子代的酶带，就不错对限定它们的基因进行遗传分析。如同其他的步地标识，同工酶手脚生化遗传标识已庸碌应用于基因作图、发育遗传学、群体遗传学、分类学等多个规模。同工酶电泳分析是一种报复而用途庸碌的分子生物学方法。
（polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂 N，N-甲叉双丙烯酰胺在加快剂四甲基乙二胺 TEMED 和催化剂过硫酸铵的作用下团聚交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为撑持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。实验二是用到了 8%的分离胶进行核酸的分离和硝酸银染色，而本次实验进行的是卵白的分离和底物的显色。二者不同之处在于，分离卵白时泛泛需要先进行浓缩胶电泳再进行分离胶电泳。浓缩胶是由较低浓度（泛泛 5%）的丙烯酰胺组成，当样品经过浓缩胶时由于胶内网孔较分离胶（8%-15%）网孔大，样品的出动速率较快，最终使样品“堆积”在浓缩胶和分离胶之间。当样品进入分离胶时，卵白质依靠分子筛效应和电荷效应进行分离。
酯酶（Esterase）是催化酯类化合物水解成酸和（-OH）醇或酚的酶系。醋酸萘酯在酯酶的催化下水解产生醋酸和萘酚，萘酚可与坚牢蓝反应生成紫褐色的物资。因此本实验中酯酶同工酶经过非变性丙烯酰胺电泳进行迁徙分离后，依然保持活性，在加入染色液后，酯酶将底物醋酸萘酚理解成萘酚，萘酚与染料坚牢蓝 RR 盐反应生成有神采的物资，提醒的位置即是酶带所在的位置，由此鉴别出酶谱的差异，酶带神采的浅深反应出酶活性的大小。黑腹果蝇 Est-6 基因位于 3 号染色体遗传图谱的 36.8，细胞学分析位于 3L 左臂上的 68F7-F8（唾腺染色体压片中黑腹果蝇的唾腺染色体被 C.B.Bridges 分为 102 个区，这里 Est-6 的编码基因位于第 68 区。前东说念主沟通表明 Est-6 主要存在于雄蝇的前射精管中。Est-6 酶带在蛹期和刚成仙的成虫中不自大，因此需要将成仙的成虫再饲养两天以上才气保证有 Est-6 酶带。本实验中黑腹果蝇的酯酶-6（Est-6）酶带有三型，一型是仅有一条迁徙率较大的酶带，这种酶带在凝胶上泳动较快，称为 F 带，另一型仅有一条泳动较慢的带，这种酶带称为 S 带，第三型是有两条酶带，一条 F 带和一条 S 带。实质上三种带型的驱散是由 Est-6F 与 Est-6S 一双等位基因的组合不同决定的。前二型分别是纯合体 Est-6F/F 和 Est-6S/S，而第三型是杂合体 Est-6F/S。
三、实验材料、仪器和试剂黑腹果蝇的三个品系：野生型（wildtype）、残翅（vestigialwing）、黑檀体（ebonybodycolor）
1.凝胶组成液：
A. Tris-柠檬酸缓冲液：Tris15 克、柠檬酸 1.25 克用蒸馏水融解，调 pH=8.9，定容至 1000 毫升。
B. 丙烯酰胺 24 克，用 A 液融解，定容至 100 毫升。
C. 甲叉双丙烯酰胺 0.75 克，用 A 液融解，定容至 100 毫升。
D. 乙二胺四乙酸二钠 0.187 克，溶于 15 毫升 A 液中。
E. 四甲基乙烯二胺原液。
F. 过硫酸胺 0.4 克，溶于 10 毫升蒸馏水中。
G. 丙烯酰胺 10 克、甲叉双丙烯酰胺 2.5 克，溶于蒸馏水中，定容至 100 毫升。
2.电极缓冲液：
Tris6.2 克、甘氨酸 2 克，溶于 100 毫升蒸馏水中，pH=8.7，用时稀释 50 倍。
3.样品匀浆液：蔗糖 1.5 克，溴酚蓝 0.01 克，Triton×100 0.05 克溶于 10 毫升蒸馏水中。
以上溶液全部放入雪柜，0—4℃保存。f 液用极新配制的或贮存期二周内的。其他溶液均可贮用二个月。
4.染色缓冲液（0.1mol/L 磷酸缓冲液）：
14.2 克 Na2HPO4 溶于水中，用 2 mol/LHCl 调 pH 至 6.5，定容至 1000 毫升。
5.底物溶液： α-萘乙酸 1 克、β萘乙酸 0.25 克，溶于 25ml 丙酮内
6.肃清固定液：
水∶甲醇∶冰醋酸=5∶5∶1
四、实验表率1．样品处理。
将成仙至少 2 天的成虫接到一只空培养管中，速即放入雪柜冷藏室冷冻 15 min，拿出后速即置于预冷的研磨器中，按样品性量与样品匀浆液体积比 1∶ 8 加入预冷过的样品匀浆液，在冰浴中研磨。匀浆结束，置离神思中，以 3500 转/分离心三分钟。
2. 聚丙烯酰胺凝胶制备。
A．装置胶板
一个模具不错放手两块胶，分别由一块短玻璃和一块长玻璃匹配夹紧组成一个禁闭的
空间。忽闪字据胶板的厚度提前准备好与之对应的梳子。并检漏，证据不漏再制胶。
B．制备分离胶
吸取 a 液 4.9 mL、b 液 3.75mL、c 液 3.35mL、d 液 0.325mL、e 液 25μL 混匀，加入 f 液 0.125 mL 摇匀，逐渐倒入大小为 16×15×0.1cm 的垂直板电泳槽的二块玻板间。倒入后要求一无气泡、二不渗漏。然后铺上 1-2 厘米高的水层压平，这么凝胶团聚后，面上可呈水平。在室温下经 20 分钟后，凝胶与水层间出现折光不同的界面时，证明凝胶已团聚。倒去水层，用滤纸吸尽余水。该层为分离胶。
C．制备浓缩胶
吸取 a 液 2.95 mL、g 液 1 mL、e 液 5 mL、f 液 0.05 mL，混匀后倒入分离胶上部，然后插上样品梳。过 30 分钟后即团聚，该层为浓缩胶。小心抽出样品梳，这么在浓缩胶面上就留住断绝开的加样槽。用滤纸条吸净加样槽内残存的溶液。落魄电泳槽分别注入电极缓冲液。
3．上样和电泳
每个点样孔上 10 μL。在 4℃雪柜内以 150 伏特电压开动电泳，处所从负极到正极。当溴酚蓝进入分离胶后，可将电压提至 200 伏特，粗略 2.5 小时后，溴酚蓝到达底部标线处，即可终了电泳。
4．染色和固定
撬开玻璃板，小心取下凝胶，参预染色液中，染色液以染色缓冲液 30 毫升，坚牢蓝 RR10 毫升，底物溶液 1 毫升组成。室温下 5 分钟后酯酶同工酶带已澄澈自大，其中紫红色在意的即为 Est－6 酶带。取出凝胶用水冲净后参预肃清固定液中漂洗过夜。脱去底色后，酶带更为澄澈，可制成干片长期保存。可制成干片长期保存，或浸净水内，经常换水，足供一年不雅察。
5. 不雅察驱散
不雅察不同亲本的带型是否不异。表面上有三种酯酶类型，Est-6F/F，Est-6S/S 和杂合体Est-6F/S。字据酯酶在卵白胶上迁徙的速率进行差别。
五、忽闪事项1. Est－6酶带在蛹期不自大，成虫刚刚成仙时也不自大，是以作电泳分析时，如为新成仙的成虫，应转入另一培养瓶中饲养二天以上，方能澄澈地自大 Est-6酶带。
2. 实验流程中忽闪安全。凡含丙烯酰胺，甲叉双丙烯酰胺的溶液均有神经性毒，慎勿沾于皮肤及粘膜上。因此在制胶之前要进行检漏责任，确保胶板装好不漏的情况下再灌胶。
六、念念考题
实验五、小鼠骨髓细胞染色体的制备与不雅察一、 实验倡导
1. 了解期骗动物细胞进行染色体制片的一般方法极度与其他制片方法的区别。
2. 正确掌执细胞网罗、低渗、滴片等技能技能。不雅察和了解小鼠染色体的数量（20 对）及步地特征。
二、 实验旨趣
1. 每个物种染色体的数量、步地相对踏实，其上的基因决定物种滋长发育的全部信息。因此，通过染色体分析，可了解某一物种最基本的遗传方针。在此，优良的染色体标本的制作是前提。
2. 进行染色体标本的制备时，一般取自细胞分裂繁华的组织，如骨髓、淋巴细胞以及通过东说念主工培养的悬浮液。如将秋水仙素打针到动物的腹腔内，经肠系膜接收，并可转运到骨髓，驱散使正在分裂的细胞不成酿成纺锤体，染色体停留在中期景况，经过处理和制片后就不错了了的不雅察到染色体。优点是省掉了细胞培养，可取得多量分裂的细胞。污点是：这种方法是属于侵害性的，只适用于动物个体较小、来源丰富的材料。大型动物可骨髓穿刺，举例临床血液疾病的分析。
三、 实验材料、仪器和试剂
1. 低渗液：0.075M KCl。渗入压和离子强度均低于正常细胞生理要求的溶液，举例水、低渗的柠檬酸钠、氯化钠、氯化钾等。其效能取决于低渗液的化学组成、处理温度和时代。旨趣：凭借反渗入作用，使细胞扩张，染色体铺展，使粘附于染色体上的核仁物资散开，以便能在一个平面上不雅察悉数染色体步地。
2. 固定液：甲醇：冰醋酸=3:1。特征：飞快穿透细胞，将其固定并保管染色体结构的竣工；增强染色体的嗜碱性，故意于染色。单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此常用两种搀和的固定液。Carrnoy 初度使用甲醇：冰乙酸=3:1（卡诺固定液），临时竖立。长期放手影响效能，固定 15-24 分钟。必要时改变二者比例，甲醇：冰乙酸=1:1（冰乙酸比例加多）故意于细胞扩张，染色体铺开，但易使染色体湮灭，细胞翻脸
3. 秋水仙素：10-30ug/g 体重，处理 2-3 小时。使纺锤体不成酿成，从而使染色体停留在中期，不然，就莫得那么多的中期染色体存在。因为细胞分裂中期在悉数分裂期中占的比例不大。
四、 实验表率
1. 腹腔打针秋水仙素溶液：在实验前 2-3 小时，对实验用小鼠按 10-30ug/g 体重的量进行
0.4%的秋水仙素打针。
2. 取材：用断颈法正法小鼠，通过剖解取出股骨（可参考东说念主的大腿骨的位置），一定要把肌肉除净。剪开股骨头，曝显现骨髓腔。
3. 用打针器吸取 1ml 2%的柠檬酸钠，反复冲洗骨髓细胞，直至股骨变白。
4. 低渗：加入低渗液，用吸管反复奏乐几次，然后把离心管放在37度恒温水浴锅内低渗20 分钟
（使细胞充分吸水扩张而不翻脸，从而使染色体足够分散开，之后经过滴短暂的摔打和骤降温流程，使细胞很快破灭，染色体进一步分散开。要是低渗处理不够，在细胞从高处掉下后也无法摔碎，染色体将难以不雅察。）
5. 固定：加 1ml 固定液，奏乐之后放入 37 度水浴锅内固定 10 分钟
6. 制备细胞悬浮液
7. 滴片：从雪柜取出预冷的载玻片，手持吸管在载玻片上方 30-40cm 处向下滴片，每张片上约 2-3 滴，并吹开
8. 干燥：当然干燥
9. 染色
10. 不雅察
五、忽闪事项
影响实验驱散的报复表率：
1. 秋水仙素的打针 至关报复
2. 取骨参照东说念主的大腿骨的位置
3. 低渗装片分散不好的主要原因就在低渗上，低渗使细胞充分吸水扩张而不翻脸，一直保持在涨的很大而又不翻脸的景况。进而使得细胞内的中期染色体能足够分散开来，从而使经固定等表率后仍然处于扩张景况。之后经过滴短暂的摔打和骤降温流程，使细胞很快破灭，染色体进一步分散开。要是低渗处理不够，在细胞从高处掉下来也无法摔碎，染色体将难以不雅察。
4. 滴片越高越好，在咱们不错达到的高度边界内，基本无谓顾虑染色体摔碎的问题。
六、念念考题
实验六、一个拟南芥 InDel 分子标识遗传多态性检测和群体遗传学分析 一、实验倡导1、了解生物基因组的遗传标识的特质
2、掌执分子标识插入/缺失（InDel）的检测旨趣和方法
3、掌执 PCR 扩增技能和琼脂糖凝胶分离技能
二、实验旨趣 InDel 是指在近源种或团结物种不同个体基因之间基因组团结位点的序列发生不同大小核苷酸片断的插入或缺失（insertion-deletion），是同源序列比对产生空位（gap）的征象。InDel 在基因组中散播庸碌、密度大、数量开阔。InDel 多态性分子标识是基于插入/缺失位点两侧的序列设想特异引物进行 PCR 扩增的标识，具备共显性遗传特征，其实验仍属于长度多态性标识，可期骗纯粹的电泳平台进行分型。InDel 标识咫尺已开动应用于动植物群体遗传分析、分子接济育种以及东说念主类法医遗传学、医学会诊等规模。
InDel 产生主要与基因组的特征和 DNA 复制特地关系，还与转座子复制和插入、序列异常重组及不等交换等引物相干，大部分插入/缺失突变的产生机制咫尺仍然未知。InDel 在基因组中散播庸碌、密度大、数量开阔。就散播密度而言，Indel 仅次于 SNP，远高于 SSR，InDel 长度变化很大，平均长度为 36bp，最长可达 10000 bp，但 99%以上的 InDel 长度小于 50 bp。
拟南芥（Arabidopsis thaliana（L.）Heynh），属为十字花科、一年生细弱草本植物。别名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草，散播极其庸碌。拟南芥手脚遗传实验的材料的优点有：植株矮小，滋长周期短，拟南芥繁衍才略强，每株植物可产生数千粒种子，闭花自花传粉，基因高度纯合，基因组纯粹，遗传操作更纯粹，因为被誉为“植物中的果蝇”。拟南芥因从不同的地点汇注而被定名为不同的生态型。咫尺东说念主们辞宇宙各地共网罗到 750 多个拟南芥生态型，这些生态型在步地发育、生理反应方面存在很大差异。在拟南芥的开阔生态型中最常用的三种是 Landsberg erecta（Ler）、 Columbia（Col）和 Wassilewskija（Ws）。本实验选用 Col 和 Ler 两种生态型为亲本进行杂交，取得 F1，F1 自交后得益多量的 F2 代种子手脚本实验的材料群体。咱们拟通过一个 InDel 分子标识的 PCR 检测对 F2 群体的单株进行基因型松弛，对拟南芥的该分子标识进行群体遗传学分析。
本实验选用的 Indel 分子标识位于 3 号染色体上，在生态型 Col 上有一个 121 bp 的插入序列，使用特异引物（位于插入位点落魄游的单拷贝序列）扩增后，在 Col 和 Ler 两种生态型中的扩增条带大小分别为 511 bp 和 390 bp，序列信息暗示图如下：
假设咱们把该 InDel 标识在 Col 中的基因型定为 AA，则 Ler 中的基因型为 aa，它们杂交后的 F1 为 Aa，则 F2 自交群体中的基因型会出现 AA、Aa、aa 三种基因型，经 PCR 扩增和电泳分离检测后，以班级为单元统计 F2 群体的基因型，狡计基因型频率，卡方考试是否相宜预期分离比。
三、实验材料、仪器和试剂实验材料：滋长 8-10 天的拟南芥小苗（Col、Ler 及 F2 群体）
实验器材：1.5 mL EP 管、镊子、剪刀、马克笔、研磨棒，1 mL、200 μL 、20 μL、 2 μL
移液枪及对应枪头、1.5 ml 离神思、电泳仪、电泳槽、PCR 管、PCR 仪，天平，凝胶成像仪
实验试剂：Edward Buffer、异丙醇、70%酒精、琼脂糖、1×TAE 电泳缓冲液、Taq 酶、ddH2O、
F/R 引物、 EB（溴化乙锭）或其他相应的染料
1LEdward Buffer 配方
试剂称号
质料/g
Tris
24.228
NaCl
14.625
EDTA·2Na 9.3062
SDS（Sodium dodecyl sulfate） 5
ddH2O 调 PH=7.5，定容至 1 L
四、实验表率（一） 拟南芥 DNA 的提真金不怕火（粗提）
1. 用镊子汇注适量拟南芥样品放入标识好的 1.5 mL EP 管中。
2. 在 EP 管中加入 20 μL 的 Edward Buffer，用研磨棒将植物材料充分研磨成糊状，加入 400 μL Edward Buffer 后充分混匀，放入离神思中（忽闪要配平）12000 转离心
6 min。
3. 编削的上清液（约 380 μL）至新的 1.5 mL EP 管中，加入等体积的异丙醇（380 μL），落魄倒置离心管，充分混匀，室温静置 15~20 min。
4. 12000 转离心 6 min，弃上清（忽闪不要把千里淀倒出）。
5. 加入 600 μL 70%的酒精，倒置混匀，12000 转离心 2 min，弃上清液。
6. 相通表率 5。
7. 用 200 μL 的移液器吸出 EP 管底部残留的液体（不要遭遇千里淀）。随后放入 37℃ 烘箱干燥 15~20 分钟，直到底部的千里淀干燥不再有水渍。
8. 加入 60 μL ddH2O 融解。4℃过夜后于-20℃保存备用。
（二） PCR 扩增
1. PCR 扩增体系为 15 μL
试剂
体积（μL）
2×taq 酶
7.5
F 引物（forward primer）
0.3
R 引物（reverse primer）
0.3
模板（DNA）
2
ddH2O 4.9
Total 15
注：引物序列：F 引物 CCCACAACTTCAAACGGTTC
R 引物 CCACAACCAACAATGGATCA
2. 实验准备时可将除 DNA 外的试剂配制成 Mix，每个样品分装 13 μL 的 Mix，各自加上
2 μL 的 DNA 样品，瞬时离心 2~3 s，将悉数试剂千里入管底。
3. 将 PCR 管放入 PCR 仪中，按照如下表率进行扩增。
PCR 表率：
（三）PCR 扩增产品的琼脂糖凝胶电泳分离
用 1×TAE 配制 1.5-2%的琼脂糖凝胶。80-100 V 电压下电泳分离，20-30 min 后凝胶成像仪中拍照、纪录电泳驱散。
（五）实验驱散
PCR 表率运行终了，取出管子，瞬时离心 3s，每个管中加入 2 μL 的 loading buffer（如用蓝酶扩增，则不需要再加入染料，可径直进行电泳检测），混匀，每个管取 10 μL 的 PCR 产品进行电泳分离（2%的琼脂糖凝胶，120 V 电泳 30 分钟），下图所示为两个亲本及 F1 的检测驱散，F1 中因同期具有两种大小的模板，扩增的时候优先扩增较小的片断，是以 390 bp 的片断更亮一些。
M Col Ler F1
1. PCR 各组分加入一个 PCR 管后不要健忘瞬时离心，PCR 表率终了后也要瞬时离心一下。
2. DNA 提真金不怕火时严谨样品间混用枪头，幸免样品间的污染，吸头不要万古间泄露于空气中，幸免气溶胶的污染六、念念考题
每个同学作念两个样品（汇注 2 株拟南芥小苗植物组织，要是植物稍大，一派真叶即可，要是植物较小，就用悉数地上部分），以一个实验班为一个统计单元，分别纪录三种基因型的个体的数据，进行卡方考试，考试是否相宜预期的 1：2：1 的分离比，要是不相宜，请分析可能的原因。
附录：拟南芥 Col 模板序列信息
0.4%的秋水仙素
2%的柠檬酸钠
甲醇：冰醋酸=3:1
0.075M KCl。
甲醇：冰乙酸=1:1
载玻片
盖玻片
卡宝品红
提前 2.5 小时打针秋水仙素
本周三晚上 18:30-22:30 ：原双周三下昼的班 余君萍（小鼠到的早就早点开动）
本周四上昼 8:00-12:00 ：原单周四上昼的班 张科进
本周五下昼 13:00-17:00 ：原单周五下昼的班 余君萍
本周五晚上 17:00-21:00 ：原单周三下昼的班 王玉华